Clostridium Botulinum

Cette bactérie est responsable d’une neuro-intoxication, le botulisme. Le plus souvent la maladie est consécutive à l’ingestion de toxine préformée dans un aliment contaminé par cette espèce. Cette maladie cosmopolite est redoutable.

HISTORIQUE :

Le terme de botulisme est lié au fait que les premiers cas cliniques décrits étaient consécutifs à l’ingestion de saucisse (du latin botulus).

En 1895 Van Ermengen décrit le germe et la maladie. Différents sérotypes ont été décrits depuis cette date, Gimenez et Ciccarelli ont montré que certaines souches pouvaient produire deux toxines.

I – CLASSIFICATION :

C. botulinum regroupe différentes expèces produisant une neurotoxine qui est responsable d’un même syndrome clinique : le botulisme.

Les souches de C. botulinum ont un CG% compris entre 26 et 28 %, contre 22 à 55 % pour l’ensemble des Clostridium.

La nomenclature habituelle distingue quatre groupes de C. botulinum :

– Groupe I. Souches protéolytiques. Types toxiniques A, B, F

– Groupe II. Toxine de type E et souches non protéolytiques de type B et F.

– Groupe III. Toxines de type C et D, le plus souvent aviaires.

– Groupe IV. Toxine de type G ; le nom de C. argentinense a été proposé à la place de C. botulinum pour désigner ces souches.

La situation est compliquée par le fait que d’autres Clostridium : C. baratii et C. butyricum sont capables de produire de la toxine botulinique (Tableau I).

II – HABITAT – TRANSMISSION :

C. botulinum est un germe tellurique très répandu dans la nature, mais la maladie est rare, car l’ingestion de la bactérie ne produit en général pas d’effets.

La bactérie existe sous forme de spores dans la terre, la boue et l’eau. Les végétaux sont contaminés par la spore (fruits, légumes, fourrages). La spore est présente dans l’intestin de nombreux animaux : équidés, moutons, et porcs. Les poissons se contaminent au contact de la boue.

Pour qu’il y ait maladie, il faut qu’il y ait ingestion d’une quantité suffisante de toxine. Cette toxine n’est produite que si la spore survit dans l’aliment pour donner une forme végétative productrice de toxine.

La contamination de la viande peut survenir de deux manières :

– à l’abattage en période de digestion : la bactériémie post-prandiale entraîne une diffusion dans les muscles,

– du fait d’une souillure par le contenu intestinal,

La persistance des spores est favorisée par :

– une mauvaise conservation de l’aliment (fumage et saumurage défectueux),

– une stérilisation insuffisante (température inférieure à 100°C).

La transformation de la spore en forme végétative devient possible dans plusieurs conditions :

– salure insuffisante (NaCl inférieur à 10 %, acide acétique inférieur à 2 %),

– température proche de la température ambiante permettant la multiplication de la bactérie,

– anaérobiose réalisée dans des aliments, au contact de l’os pour les jambons, sous la couche de graisse (pâtés), ou du fait d’emballages étanches,

– présence de glucides (conserves de fruits et légumes).

La production de la toxine dans l’aliment demande un certain délai, en moyenne huit jours à 26°C. La libération serait favorisée par des associations microbiennes qui lysent C. botulinum.

La toxine étant thermolabile, l’aliment est dangereux quand il est ingéré cru.

Exceptionnellement le botulisme peut se développer par production de toxine au niveau d’une plaie infectée ou au niveau de l’intestin.

III – PHYSIOPATHOLOGIE :

On distingue deux formes de botulisme : l’intoxication et la toxi-infection. Chez certains nourrissons C. botulinum. s’implante dans l’intestin et libère la toxine synthétisée in situ.

Toxine et bactérie ingérées passent sans dommage la barrière gastrique. La toxine retrouvée dans l’intestin correspond à la toxine ingérée et à la toxine libérée lors de la lyse bactérienne, cette toxine résiste donc à l’acidité gastrique et aux sucs digestifs.

Une fois dans l’intestin elle passe dans les lymphatiques puis dans le sang et va se fixer sur le tissu nerveux. L’intoxication se traduit par une paralysie générale (de type flasque) de l’activité neuromusculaire et du système nerveux autonome.

L’action de la toxine s’exerce surtout sur le système nerveux périphérique, à la différence de la toxine tétanique qui agit surtout sur le système nerveux central.

Chez l’homme, il y a une diminution de l’activité :

– du nerf vague,

– des nerfs de contraction vésicale, des organes sécrétoires, oculomoteurs,

– des motoneurones.

Mode d’action :

La toxine empêche la transmission cholinergique dont le médiateur est l’acétylcholine et agit surtout sur les terminaisons nerveuses

– des fibres nerveuses préganglionnaires parasympathiques, sympathiques et du système nerveux autonome,

– des fibres du système nerveux parasympathique,

– des fibres des motoneurones innervant les muscles striés.

Mécanisme :

L’acétylcholine agit de la manière indiquée sur la figure 1 au niveau de la plaque neuromusculaire.

La toxine inhibe la libération de l’acétylcholine, en empêchant l’activation du mécanisme de libération par les ions Ça »1″1″.

IV – POUVOIR PATHOGÈNE NATUREL :

A – Pour l’animal :

Les bovins contractent la maladie par ingestion de fourrages moisis, contaminés par des cadavres de rongeurs (botulisme A, B ,D).

Les ovins peuvent aussi être touchés. Le botulisme équin peut décimer des écuries entières (botulisme B). Le botulisme aviaire (botulisme C) provoque des paralysies flasques des muscles du cou.

Expérimentalement si le cobaye est l’animal de choix, les souris sont très sensibles également à la toxine, comme le singe, le chat et le lapin.

B – Pour l’homme :

II s’agit souvent de petites épidémies familiales ou touchant les convives d’un même repas.

1. C’est essentiellement une « intoxination » liée à l’ingestion de toxine préformée :

Les aliments impliqués sont classiquement :

– les conserves familiales, artisanales insuffisamment stérilisées, les viandes surtout de porc : jambons fumés, confits, foie gras (botulisme B)

– les fruits et légumes souillés par de la terre, notamment aux U.S.A. (botulisme A)

– les poissons de mer ou de rivière : conserves, poissons crus ou fumés responsables de botulisme E et F (U.R.S.S., Canada, Japon…).

Après ingestion de l’aliment contaminé on distingue :

– La période d’incubation qui peut être de 8 à 12 heures en cas de botulisme suraigu, mais qui peut atteindre 2 à 3 semaines.

– La période d’invasion retrouvée dans la moitié des cas, comportant des signes digestifs non spécifiques (nausées, vomissements, diarrhée).

– La phase d’état caractérisée dans les formes typiques par

a/ Des troubles moteurs :

– oculaires : avec comme premier signe la paralysie de l’accommodation avec vision floue de près, suivie de mydriase, puis d’atteintes extrinsèques (ptosis, strabisme, diplopie),

– buccopharyngé : avec dysphagie douloureuse pouvant entraîner des fausses routes,

– oesophagiens, coliques, vésicaux…, d’autres paralysies peuvent toucher les muscles du dos, de la nuque, des membres voire le diaphragme.

b/ Des troubles secrétaires :

Avec tarissement des sécrétions lacrymales, salivaires, de l’ensemble du tractus digestif, sudoral, lacté. L’assèchement des muqueuses favorise les surinfections.

c/ Des signes négatifs :

Pas de fièvre, pas d’atteinte cardiovasculaire, pas de troubles de la conscience ; et de plus les paramètres biologiques du LCR sont dans la limite de la normale.

– L’évolution est le plus souvent favorable en France (4 % de décès), plus grave aux États Unis (50-60 % de décès). Les formes mortelles se retrouvent souvent parmi les formes à incubation courte et avec certains sérotypes (types A et E). Le pronostic varie également avec la quantité d’aliments ingérée et avec le degré d’hydratation des aliments. Les aliments très hydratés contiennent plus de toxine.

2. C’est plus rarement une « Toxi-infection » :

Le germe est alors isolé chez le malade lui-même au niveau de plaies souillées avec gangrène ou au niveau des sites d’injections parentérales (plus de 40 cas aux USA).

Récemment des cas de mort subite du nourrisson ont été attribués à C. botulinum.

Le germe ingéré, par exemple avec des aliments lactés contenant du miel, s’implante dans l’intestin et y sécrète sa toxine. Il y a toxinogénèse endogène, puis apparition de constipation, de troubles respiratoires et de décès (enfants vers la 12e semaine). Cette étiologie a été retrouvée dans 4,7 % des 21 cas de mort subite, rapportés par Amon et seraient dus à des types toxiniques rares (C, F et G) dont le pouvoir pathogène chez l’homme n’est pas toujours bien documenté. On ne sait pas très bien pourquoi le germe peut s’implanter dans la flore intestinale de l’enfant de moins de 1 an, mais il faut noter que dans un certain nombre de cas exceptionnels chez l’adulte cette colonisation peut exister.

Chez certains animaux cette implantation ne peut se faire que durant une période très courte de la vie.

V – CARACTÈRES BACTÉRIOLOGIQUES :

A – Forme végétative :

1. Morphologie :

C. botulinum est un bacille à Gram positif (faible) aux extrémités arrondies de 4-8 µm sur 0,9-1,2 µm. Il est mobile (6 à 20 cils péritriches). Il n’est pas capsulé.

Dans les cultures jeunes, on peut observer de courtes chaînettes. A l’inverse dans les cultures âgées, on observe des formes d’involution vacuolaires et des spores.

2. Cultures :

— C’est un germe anaérobie strict pour lequel les meilleures conditions de

croissance sont une température de 26 à 28°C et un pH alcalin (8 à 8,4).

— Aspect des colonies :

– en gélose profonde VF ou VL additionnée de sang, de jaune d’oeuf, elles sont lenticulaires, les parois sont lisses, parfois épineuses en oursin (Figure 2).

– en surface les colonies sont circulaires et jaunâtres.

3. Caractères biochimiques (Tableau II) :

La principale source énergétique est glucidique : glucose, maltose, lévulose… en libérant des acides acétique, butyrique (odeur de beurre rance caractéristique), et en plus faible quantité acide lactique. Les souches de type D sont plus glucidolytiques ; les souches de type C le sont moins.

Action protéolytique : protéolyse plus ou moins marquée selon les types. A et B sont gélatine (+), décarboxylase (+), désaminase (+)…, C, D et E sont peu protéolytiques. Le type B produit une hémolysine.

Pouvoir lipolytique très marqué pour C. botu.linu.rn A, B et F.

Pouvoir réducteur élevé pour A, faible pour B, C, E.

* déterminés en chromatographie gaz-liquide

A. Ac. acétique, B. Ac.butyrique, iB. Ac. isobutyrique, P. Ac. propionique, iV. Ac.isovalérique

4. Vitalité réduite :

Bactérie végétative détruite en 30 minutes à 60°C ou en 2 minutes à 80°C, mais dans ces conditions la sporulation est rapide.

B – Spore :

La sporulation est favorisée par les conditions de vie difficiles et par l’arginine.

La spore est ovoïde, déformante, subterminale.

La spore est très thermorésistante, ainsi en 8 minutes à 115°C on tue 95 % des spores, les 5 % restantes résistent 5-10 minutes à 120°C.

La thermorésistance est variable selon les sérotypes, diminuant dans l’ordre suivant C, A, B, D, E ; elle est favorisée par une faible salure (1 à 6 %o) ou les lipides.

La spore résiste aux antiseptiques : il faut 24 heures pour détruire les spores avec du formol à 20 %.

C. botulinum sérotype A est l’une des bactéries les plus radiorésistantes.

Les spores de C. botulinum sont également assez résistantes à divers agents bactéricides : U.V., hypochlorite, alcool, ammoniums quaternaires.

La germination est inhibée par le NaCl (10 à 15 %), certains acides gras et des substances antibiotiques produites par certaines bactéries, tel B. subtilis.

C – Toxine :

1. Production :

– Elle est sécrétée par la bactérie en phase exponentielle de croissance ; elle est en partie endocellulaire et passe secondairement dans le milieu extérieur lors de la lyse des bactéries.

– Elle est parfois sécrétée sous forme inactive : protoxines A et E, et activée par des enzymes protéolytiques de la bactérie.

– Les milieux utilisés pour obtenir une bonne synthèse de la toxine sont à base d’hydrolysat de caséine ou de bouillon VF glucose à 5 %o. La température optimale de synthèse est comprise entre 30 et 37°C, elle est inhibée en dessous de 10°C, mais pas par une température « ambiante » de 25°C.

– L’optimum de production dans les cultures se situe vers le 6e jour.

– La synthèse de la toxine, au moins pour les types C et D, est sous la dépendance de phages lysogènes, les souches non lysogènes n’étant pas virulentes.

De même la présence de plasmides a été corrélée notamment avec la production de la toxine G.

2. Propriétés :

La toxine est de nature protéique, le poids moléculaire est élevé (Tableau III) allant de 141 kDa à 170 kDa. On distingue une chaîne lourde (100 kDa) et une chaîne légère (50 kDa) liées par un pont disulfure. La toxine est initialement synthétisée sous la forme d’une seule chaîne qui est ensuite scindée par une enzyme protéolytique d’origine endogène ou exogène. Au sein du type C on distingue une neurotoxine majeure dite C2 et une seconde toxine mineure C2 différente ayant une action sur la perméabilité vasculaire et une action létale.

Pendant longtemps on a pensé que les PM étaient beaucoup plus élevés allant jusqu’à 900 kDa, mais les toxines existent sous forme de polymères. La toxine a pu être obtenue sous forme cristallisée. Les toxines sont riches en asparagine et en glutamine.

3. Toxicité :

C’est la substance la plus active parmi les produits biologiques connus : 1 mg de toxine A cristallisée représente 31 millions de DMM souris et 1,2 millions de DMM kg cobaye. La toxicité dépend :

– de la voie d’administration. La voie orale est la moins efficace. Sous forme déshydratée, le simple contact de la toxine avec la conjonctive a provoqué le décès d’un chercheur,

– de l’animal, souris et cobaye sont très sensibles.

Le dosage de la toxine s’effectue par étude du pouvoir pathogène pour la souris (DMM, DL 50), par hémagglutination passive, par précipitation (floculation initiale de Ramon)… Les toxines sont antigéniques, transformables en anatoxine par le formol et la chaleur.

4. Stabilité :

Les toxines sont :

– thermolabiles détruites à 80°C en 15 minutes, en 10 minutes à 100°C, les toxines C et D sont les plus thermorésistantes ;

– sensibles aux oxydants (eau de Javel), à la lumière ;

– stables à pH 3, et résistent donc à l’acidité gastrique chez l’homme ; les vautours posséderaient des enzymes digestives détruisant la toxine contenue dans les cadavres.

5. Sérotypes :

On connait actuellement 7 sérotypes désignés par les lettres A à G. La répartition des sérotypes, l’habitat, la zone géographique de chaque sérotype, ainsi que la mortalité qui leur incombe figurent dans le tableau I. Le type B est presque toujours en cause en France.

6. Usage thérapeutique :

La neurotoxine de type A est utilisée dans le traitement de troubles neuromusculaires (dystonie spastique et torticolis spasmodique) et ophtalmologiques (strabisme, blépharospasme).

D – Autres antigènes :

En dehors des toxines, il existe des facteurs hémolytiques, hémagglutinants, qui ne paraissent pas liés à la toxine. On reconnait aussi des antigènes somatiques thermostables et des antigènes flagellaires thermolabiles. On a reconnu 3 sous-types H pour les souches A et 4 pour les souches B.

VI – DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DU BOTULISME :

A – Recherche de la toxine dans le sérum du malade :

Cet examen a un grand intérêt. Il permet le diagnostic des formes frustes ou à porte d’entrée non digestive. La toxinémie apparaît vers le 2e jour de la maladie et persiste 2 à 3 semaines. Cet examen doit être pratiqué avant administration éventuelle au malade de sérum antibotulinique ou de médications neurotropes. Il nécessite environ 20 ml de sang.

La toxémie est recherchée par inoculation par voie intra-péritonéale du sérum du patient à la souris, en utilisant des animaux protégés par les divers antisérums et des animaux non protégés.

Dans des cas exceptionnels, la recherche de la toxine peut se faire dans les selles ou les produits de vomissements du malade, une aspiration gastrique, voire dans le sérum ou les viscères post-mortem.

B – Recherche de la toxine dans l’aliment suspect :

II est indispensable lors d’une suspicion d’un botulisme de retrouver les aliments

suspects et de les adresser en même temps que le patient à l’établissement hospitalier.

1. Mise en évidence de la toxine :

Elle se fait par la recherche du pouvoir pathogène sur animal et épreuve de l’animal protégé.

– on prélève la zone suspecte de l’aliment, par exemple pour les jambons la moelle osseuse, la zone située près de l’os là où la chair a un aspect rosé ;

– on broie les tissus prélevés dans du sérum physiologique ou un tampon, on broie le tout en maintenant une température basse, on centrifuge à basse vitesse pour éliminer les grosses particules, on pourra rechercher le germe sur le culot, la toxine sera recherchée sur le surnageant ;

– pour la recherche et le titrage de la toxine, on inocule des souris avec des volumes croissants de surnageant par voie intra-péritonéale : 0,1 – 0,25 – 0,5 – 1 ml (5 souris par dose). On utilise parfois à l’aveugle, pour un premier screening 0,25 ml par souris mais le titrage sera important pour réussir ultérieurement la neutralisation ;

– l’épreuve de séro-neutralisation permettra de vérifier que c’est bien de la toxine botulique qui a tué l’animal non protégé, mais aussi de déterminer le sérotype en cause. Pour cela on met en présence un certain volume de surnageant (2 à 10 DMM) et du sérum anti A, le même volume de surnageant et du sérum anti B, etc. Après avoir laissé en contact durant 30 minutes à 37°C, on injecte chaque mélange à plusieurs animaux par voie intrapéritonéale (Schéma).

La présence de toxine est révélée par le décès des animaux en 24 ou 48 heures dans un tableau de paralysie flasque. Le type toxinique sera reconnu par la neutralisation de ce pouvoir pathogène à l’aide de l’antisérum spécifique.

Cette mise en évidence de la toxine se heurte cependant à un certain nombre de difficultés qu’il ne faut pas négliger : la mort de l’animal peut ne pas être due à une action toxinique. En effet, la présence de métaux lourds, d’autres toxiques ou l’hyperosmolarité créée lors de l’inoculation peuvent amener des erreurs de diagnostic.

2. Isolement du germe :

Pour la culture, on part soit du culot, soit du surnageant si la centrifugation a été peu rapide. On traite alors l’extrait par la chaleur durant 30 minutes à 75°C ou 10 minutes à 100°C pour sélectionner les spores. On ensemence ensuite un milieu VF glucose, qui est placé à 33°C durant 7 à 8 jours. On recherche alors la production de toxine sur la culture par inoculation à l’animal. On pourra procéder à un isolement de la souche et ensemencer une galerie d’identification.

Une recherche du germe pourrait aussi se faire directement sur l’aliment en immuno-fluorescence avec des sérums anti-C.botulinum ; mais la spécificité de cette technique est discutable notamment entre sérotypes et aussi entre espèces. De fausses réactions ont été notées notamment avec C. sporogenes.

Récemment une méthode ELISA a été décrite pour détecter les toxines A et B dans les aliments grâce à des anticorps monoclonaux.

VII – TRAITEMENT :

A – Le traitement prophylactique :

II concerne les aliments.

1. Préparation :

– Les aliments destinés aux conserves doivent être soigneusement lavés pour les débarrasser de la terre (fruits, légumes…) ;

– Les animaux servant à la préparation de jambon par exemple, doivent être laissés à jeun et au repos au moins 24 heures avant l’abattage, ;

– Les poissons destinés à la consommation ou aux conserves doivent être éviscérés.

2. Conservation :

– La stérilisation doit être suffisante pour les conserves (120°C à l’autoclave),

– La salaison, l’emploi d’acide acétique, l’acide ascorbique et le nitrite de Na peuvent éviter l’anaérobiose,

– Les emballages sous cellophane favorisent l’anaérobiose,

– La congélation ne détruit pas la toxine, mais empêche sa formation.

3. Consommation :

– Éviter tout aliment suspect (odeur butyrique, rance) viande avec aspect suspect, boîtes de conserves bombées, ou sous pression lors de l’ouverture (jet),

– La cuisson détruit la plupart des toxines, ce qui ne saurait justifier l’ingestion d’un aliment suspect même chauffé.

B – Le traitement curatif :

1. Il est avant tout symptomatique :

Hospitalisation dans un service de réanimation, pour prévenir l’arrêt respiratoire (intubation trachéale, respiration assistée), et les infections provenant des muqueuses altérées par l’absence de sécrétions (désinfection).

2. Les traitements spécifiques ou reposant sur des bases physiopathoîogiques ont une efficacité plus discutable :

– La sérothérapie spécifique polyvalente avant sérotypage de la toxine, puis monovalente, a une action neutralisante sur la toxine circulante (en l’absence de traitement, la toxine sérique peut persister plusieurs semaines), mais elle ne mobilise pas la toxine fixée sur les centres nerveux. Il faut en outre éviter la maladie sérique (corticoïdes),

– L’anatoxinothérapie peut rendre service en raison de l’évolution prolongée de la maladie.

– Le chlorure de guanidine réduirait les manifestations neurologiques du botulisme,

– Le monoacétate de guanine a aussi été essayé.

En fait un consensus semble se faire pour reconnaître que ces traitements n’influencent pas significativement l’évolution du botulisme.