Legionella

HISTORIQUE :

L’histoire de la découverte de ce nouveau genre bactérien constitue un modèle de recherche épidémiologique et bactériologique par la remarquable organisation de l’enquête réalisée sur le terrain et les moyens déployés.

Du 21 au 24 juillet 1976 a eu lieu à l’Hôtel Bellevue-Stratford de Philadelphie, le 58e congrès de l’American Légion (anciens combattants).

Parmi les 4400 participants, 182 personnes (légionnaires et accompagnants) furent atteintes de pneumopathie, 15,9 % en moururent. Seize autres personnes présentèrent des formes asymptomatiques découvertes a posteriori. Des cas identiques (appelés « pneumonies de la grand-rue ») furent observés chez des personnes qui n’étaient pas entrées dans l’hôtel, mais s’étaient trouvées dans la rue proche durant le même mois de juillet ; de même, d’autres cas furent observés chez des participants à d’autres reunions dans le même hôtel. La notion d’épidémie n’apparut pas tout de suite car la plupart des cas ne se déclarèrent qu’après la fin du congrès et ce n’est que trois jours plus tard que les praticiens de la ville alertèrent les services sanitaires, déclenchant ainsi une vaste enquête épidémiologique.

Il apparut alors que la contamination s’était faite par voie aérienne dans le hall de l’hôtel ou sur le trottoir. L’agent causal, infectieux ou non, fut alors activement recherché. On chercha ainsi longtemps un métal ou un autre agent toxique dans les tissus des sujets décédés ; d’autre part, on employa 14 types de milieux bactériologiques ou mycologiques et 13 types de cultures cellulaires afin de mettre en évidence un éventuel agent infectieux.

Finalement, le 18 janvier 1977, Mac Dade et coll. annoncèrent qu’une bactérie à Gram négatif avait été isolée de fragments pulmonaires provenant de 4 des sujets décédés. Ces broyais de poumon furent inoculés, par voie péritonéale, à des cobayes qui présentèrent en quelques jours une maladie fébrile mortelle. Les examens de frottis de foie et de rate montrèrent de nombreux bacilles et l’inoculation d’un broyât de ces organes dans la membrane vitelline d’oeufs embryonnés entraîna leur mort en 4 à 6 jours. Le rôle étiologique de cette bactérie dans l’épidémie de Philadelphie fut démontré par immunofluorescence indirecte sur des sérums de convalescents de la maladie.

Ultérieurement, des enquêtes sérologiques rétrospectives permirent de rattacher à cette maladie plusieurs épidémies de pneumopathies aiguës inexpliquées.

En 1974 à Philadelphie, vingt personnes participaient à un congrès à l’Hôtel Bellevue-Stratford, onze développaient une pneunopathie sévère, deux en décédaient.

En 1973 à Benidorm en Espagne, huit touristes écossais contractaient des infections pulmonaires, trois en mouraient. Ils avaient tous séjourné dans le même hôtel en juillet.

En 1965 à Washington D.C., on recensait à l’hôpital psychiatrique Sainte-Elisabeth 81 malades atteints de pneumonie grave dont 14 décédaient. L’infection avait touché les sujets dormant la fenêtre ouverte sur le parc et ceux se promenant dans ce même parc où des travaux de terrassement étaient effectués.

En 1968 à Pontiac, Michigan, on recensait 144 cas de maladies fébriles aiguës bénignes chez les employés et les clients d’un centre de santé. L’infection était synchronisée avec la mise en marche du système de climatisation.

En 1943, Tatiock avait isolé une souche de L. micdadei sous l’appellation « Rickettsia-like ».

On constata donc qu’il ne s’agissait pas d’une maladie nouvelle. Finalement, en 1980, cette bactérie fut dénommée Legionella pneumophila.

I – TAXONOMIE – CLASSIFICATION :

Les Legionella appartiennent à une nouvelle famille bactérienne : celle des Legionellaceae.

La classification généralement admise est celle de Brenner : la famille des Legionellaceae ne comporte actuellement qu’un seul genre : Legionella, avec près d’une trentaine d’espèces identifiées par hybridation ADN/ADN et étude en chromatographie de partage gaz-liquide (tableau I). L’espèce type est L. pneumophila qui est la plus fréquente en pathologie médicale et qui comporte 14 sérogroupes.

Certains auteurs mentionnent de nettes différences parmi les espèces du genre Legionella et parlent de bactéries voisines dénommées Fluoribacter (F. bozemanae, F. dumoffii. F. gormanii) Tatiockia (L. micdadei, L. maceachernii).

II – ÉCOLOGIE :

A – Habitat :

Les Legionella sont des bactéries aquatiques banales de notre environnement naturel. On les trouve dans l’eau (chaude de préférence) où leur survie est longue : lacs, rivières, marais, terres humides, conduites d’eau ; dans l’air : vapeur d’eau, aérosols, nébulisateurs.

L’étude des cas de légionellose a montré que la présence du germe est liée à la

proximité de travaux de terrassement, de réservoirs hydriques, d’aérosols engendrés

soit par les tours de réfrigération des systèmes de climatisation, soit par les

pommeaux de douches, les robinets grand ouverts…

Ces bactéries aux conditions de culture pourtant exigeantes peuvent s’y développer, atteignant des concentrations de l’ordre de 106 bactéries par litre. Il semble que la présence d’une flore microscopique associée (Pseudomonas, Flavobacterium, protozoaires…) facilite la croissance des Legionella. On insiste notamment sur le rôle des amibes libres (genres Acanthamoeba et Naeglerià) qui, en ingérant sans les détruire les Legionella, semblent leur fournir de parfaites conditions de survie et de dissémination.

Ces bactéries sont tuées par une chaleur supérieure à 65°C et la chloration de l’eau.

B – Épidémiologie :

II a été montré que les Legionella (essentiellement L. pneumophila sérogroupe 4) étaient présentes dans 60 % des prélèvements d’eaux effectués en ville.

Par ailleurs la prévalence des Legionella dans les pneumonies est modeste (environ 4 %), il semble donc que la notion de terrain soit très importante.

La présence de Legionella dans un prélèvement d’eau ne doit donc pas inquiéter, hormis dans un service d’immunodéprimés (greffés, hémopathies) où la stérilisation de l’eau devra être envisagée.

D faut noter qu’il n’y a pas de transmission d’un individu à l’autre et que le portage sain est exceptionnel.

Pour surveiller les contaminations humaines, la légionellose est aujourd’hui une maladie à déclaration obligatoire (voir annexe).

III – POUVOIR PATHOGÈNE :

A – Pouvoir pathogène naturel :

Les infections humaines sont généralement dues à L. pneumophila (90 % des cas), les autres espèces étant plus rarement en cause et leur pathogénicité encore mal connue.

Les légionelloses surviennent en général sur un terrain particulier. Elles touchent plus souvent l’homme de plus de 50 ans, le fumeur, l’éthylique, les personnes porteuses d’une affection cardiopulmonaire chronique, d’une insuffisance rénale chronique ou d’un diabète, les sujets en état d’immunodépression cellulaire.

1. Forme clinique habituelle : la maladie des légionnaires

L’incubation dure 2 à 10 jours. Après un début progressif, le malade présente la phase d’état : un syndrome infectieux intense et une atteinte respiratoire (pneumonie extensive mal systématisée), souvent associée à un épanchement pleural.

Dans 1/4 des cas, il existe des troubles neurologiques sans signes de focalisation (céphalées, confusion mentale, crises convulsives). La ponction lombaire est le plus souvent normale. Il existe rarement une méningite, une encéphalite, une polyradiculonévrite. Le mécanisme le plus souvent avancé est celui d’une toxine neurotrope.

Les troubles digestifs sont fréquents (diarrhées notamment).

Dans le tableau biologique, il existe souvent des signes biologiques d’atteintes hépatique et rénale ; on note aussi une hyponatrémie et une hypophosphorémie.

Le diagnostic de légionellose est donc à évoquer devant une pneumopathie très fébrile extensive associée à des manifestations extra-pulmonaires (diarrhée) survenant sur un terrain privilégié, pour laquelle les examens bactériologiques usuels sont négatifs.

2. Autres formes cliniques :

a/ Légionellose des immunodéprimés (légionelloses nosocomiales) :

Les sujets transplantés, les malades ayant une leucémie à tricho-leucocytes, ou un cancer bronchique constituent des groupes à très haut risque. Pour les sujets atteints de SIDA, cancers génitaux ou du sein, ce risque semble plus faible.

L’étiologie généralement plurimicrobienne et un terrain fragile font que l’évolution est souvent très grave avec un taux de létalité très élevé (environ 40 %).

b/ La fièvre de Pontiac :

C’est une atteinte bénigne des voies aériennes supérieures, causée par une souche particulière de L. pneumophila sérogroupe 1.

L’incubation est courte (36 heures), les clichés pulmonaires sont normaux, la guérison est spontanée en quelques jours.

c/ Les formes inapparentes sont fréquentes :

Les études sérologiques montrent que plus de 10 % de la population a un taux élevé d’anticorps aaû-pneumophila sérogroupe 1.

d/ Autres formes :

hématologiques, rénales, cérébrales, cutanées, cardiaques (valve artificielle) ou musculaires.

B – Pouvoir pathogène expérimental :

Le cobaye inoculé par voie intra-péritonéale développe une maladie fébrile évoluant vers la mort en quelques jours.

On observe pendant les 4 premiers jours une péritonite, puis le germe passe dans les vaisseaux sanguins et les lymphatiques. Des foyers de nécrose apparaissent ensuite au niveau de la rate, du foie, des poumons où l’on retrouve ces germes en grand nombre.

Les bacilles sont phagocytés par les monocytes-macrophages, cellules dans lesquelles les Legionella peuvent survivre. La lyse de ces cellules immunitaires est à l’origine de la dissémination microbienne.

Une réaction d’hypersensibilité retardée (HSR) a été mise en évidence chez des cobayes sensibilisés après inoculation de bactéries vivantes ou tuées par la chaleur.

Cette HSR est détectée par l’antigène protéique commun aux divers sérogroupes de L. pneumophila.

Cette bactérie possède une endotoxine dont l’activité in vivo est beaucoup plus faible que celle des autres bactéries à Gram négatif. L. pneumophila, L. micdadei, L. bozemanii possèdent un antigène de virulence mip (macrophage infectivity potentiator) dont le gène porté par un plasmide a été clone et séquence.

IV – DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DES INFECTIONS A LEGIONELLA :

A – Prélèvements utilisés et conditions de transport :

La recherche peut être effectuée sur des lavages broncho-alvéolaires de préférence ou sur des ponctions transtrachéales, des biopsies pulmonaires, des culots de centrifugation de liquide pleural, des hémocultures, des fragments d’organes divers, éventuellement des urines, des selles.

Tous ces prélèvements seront recueillis le plus stérilement possible pour éviter une contamination. Pour prévenir la dessication on ajoutera un peu d’eau stérile (ne pas employer de sérum physiologique qui risque d’inhiber la culture). De même, lors du prélèvement, il est préférable d’éviter les anesthésiques locaux (lidocaïne).

Si le délai de transport au laboratoire excède 30 minutes, il est conseillé de conserver le prélèvement à + 4°C. Si l’acheminement est différé de plus de 24 ou 48 heures, le prélèvement sera congelé à -20°C au minimum. Ces précautions sont valables pour les cultures et pour les recherches par immunofluorescence directe.

B – Recherche de Legionella par immunofluorescence directe dans les produits pathologiques :

1. Principe :

On utilise des anticorps dirigés contre les diverses espèces et différents sérogroupes de Legionella. û existe également un anticorps monoclonal spécifique de l’espèce Legionella pneumophila qui reconnait un antigène protéique situé sur la membrane externe de tous les sérogroupes connus de L. pneumophila. Ces anticorps sont conjugués à de la fluorescéine.

Chez un malade traité depuis moins de 3 jours, cet examen est encore possible quoique moins sensible, mais la lecture est plus difficile, les corps bactériens perdant leur morphologie habituelle. De plus il existe une fluorescence de fond due à la lyse bactérienne.

L’IFD peut être pratiqué sur les produits frais ou conservés dans le formol ou dans la paraffine.

2. Réalisation pratique :

On effectue plusieurs frottis en couche mince, l’un est coloré par la technique de Gram pour appécier la flore dominante. A noter que les Legionella ne sont pas visualisées par la coloration de Gram usuelle. Cette bactérie est colorée au Gram en utilisant de la fuschine phéniquée basique. Il apparaît alors Gram négatif.

Pour l’IFD on utilise généralement 3 pools de conjugués fluorescents :

– A : L. pneumophila sérogroupes 1, 2, 3 et 4.

– B : L. pneumophila 5 et 6, L. dumoffii, L. longbeachae 1.

– C : L. gormanii, L. micdadei, L. longbeachae 2, L. bozemanii.

L’examen sera dit positif si on voit plus de 5 petits bacilles franchement fluorescents (vert pomme) et ayant une morphologie typique (souvent incurvés, polymorphes). Ces bacilles sont intra et extra-leucocytaires.

3. Intérêt – Limites :

L’intérêt majeur de cette technique est sa rapidité (environ 1 h). Sa sensibilité est médiocre et fonction du prélèvement examiné (30 à 50 %).

Un examen négatif ne doit donc pas faire éliminer ce diagnostic, il est obligatoire de pratiquer des cultures.

La spécificité est bonne, mais il peut exister quelques réactions croisées avec Pseudomonas, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Bacteroidesfragilis. La spécificité est améliorée par l’emploi d’anticorps monoclonaux.

C – Culture et isolement :

1. Milieux de culture :

Legionella ne peut être cultivée sur les milieux usuels. Divers milieux ont été successivement utilisés. Actuellement on n’utilise plus que le Buffered Charcoal Yeast Extract additionné d’acide alpha-céto-glutarique ou BCYE alpha incubé à 35°C sous 2,5 à 5 % de CO.

Ce milieu est rendu sélectif par l’adjonction de différents antibiotiques. On utilise le plus souvent un mélange : vancomycine, céfamandole, polymyxine B, anisomycine.

Pour les prélèvements de l’environnement on a préconisé d’ajouter un mélange : glycine, vancomycine, polymyxine (milieu GVP).

Dans la préparation de ces milieux, il est indispensable d’apporter une attention particulière à la qualité des ingrédients et à leur ordre d’adjonction ainsi qu’aux conditions de pH final qui doit être rigoureusement compris entre 6,85 et 6,95.

L’inoculation au cobaye a longtemps été utilisée. Ses résultats sont tardifs.

2. Réalisation pratique :

Avant l’ensemencement, il peut être utile de décontaminer les prélèvements pluri-microbiens tels que aspirations trachéales ou lavages broncho-alvéolaires. Pour ce faire, le prélèvement est traité par un tampon HC1 – KC1 à pH 2,2. Dans le cas de contamination par Pseudomonas aeruginosa, on traitera le prélèvement par la chaleur (1 à 2 mn à une température inférieure ou égale à 60°C).

Chaque prélèvement est ensuite ensemencé sur 6 boîtes de milieu BCYE-alpha : 3 BCYE-alpha simple et 3 BCYE-alpha sélectif. Chacune des boîtes de ces deux milieux est ensemencée avec le prélèvement pur, dilué à 10’2 et à 10″4 en eau distillée afin de diminuer la concentration des inhibiteurs naturels présents dans les produits, d’éventuels antibiotiques et de contaminants.

En ce qui concerne les prélèvements sanguins, Legionella peut croître dans des milieux spéciaux pour hémoculture (Bactec).

3. Isolement et identification :

a/ Morphologie et structure de la bactérie :

Ce sont des bacilles courts ou des cocco-bacilles de 1 à 2 µm de long sur 0,5 à 0,7 p.m de large, aérobies stricts.

In vitro, on observe des bactéries filamenteuses (jusqu’à 100 u.m de long).

Ils sont mobiles par un flagelle polaire unique.

In vivo, ils peuvent être intracellulaires.

b/ Caractères culturaux :

II s’agit d’un bacille de culture difficile ne poussant que lentement (2 à 15 jours en moyenne, voire plus dans les hémocultures). La croissance est optimale pour une température de 35°C, les limites se situant entre 25 et 48°C.

C’est un germe aérobie strict, exigeant en cystine et en fer, qui pousse mieux en présence de 2,5 à 5 % de CO^.

Les boîtes de Pétri seront examinées tous les jours (pendant 15 jours) à la loupe binoculaire. Quand les colonies apparaissent, elles ont un aspect typique dit en verre frite et peuvent être pigmentées (du bleu au rosé selon les espèces), pigment plus intense en lumière UV. Cet aspect typique, mais non spécifique n’est généralement observé que pendant 24 h. Toutes ces colonies seront prélevées et réensemencées sur BCYE-alpha dépourvu de cystéine et sur gélose au sang.

Une identification du genre Legionella peut alors être faite quand les arguments suivants sont réunis :

– aspect typique de culture sur BCYE-alpha,

– absence de culture sur BCYE-alpha dépourvu de L-cystéine, sauf pour L. jordanis et L. oakridgensis.

– absence de culture sur gélose au sang.

L’identification de l’espèce peut parfois être réalisée à l’aide de différents caractères biochimiques. On retiendra de l’espèce un caractère toujours positif (la catalase) et des caractères toujours négatifs : acidification des hydrates de carbone, nitratase, uréase (tableau II). La confirmation nécessitera souvent l’analyse des acides gras ramifiés en chromatographie en phase gazeuse (GLC), des ubiquinones en CLHP, voire l’étude du génome par hybridation ADN/ADN.

c/ Intérêt de l’isolement :

Seul l’isolement du germe permet une certitude diagnostique absolue. De plus, l’isolement de Legionella constitue le seul argument diagnostique biologique lorsque l’IFD et la sérologie sont négatives.

La comparaison des souches isolées chez les malades et dans leur environnement a un intérêt épidémiologique majeur pour déterminer l’origine exacte de la contamination.

D – Sérologie par immunofluorescence indirecte (IFI) :

1. Principe :

L’antigène est, soit Legionella cultivée sur oeuf embryonné et tuée par le formol (antigène de Taylor, le plus utilisé en Europe en raison de sa plus grande sensibilité), soit Legionella cultivée sur milieu artificiel et tuée par le formol et la chaleur (antigène de Wilkinson).

L’antigène est fixé par l’acétone sur lame. La technique utilisée est celle de l’IFI habituelle en utilisant un conjugué fluorescent anti-gamma-globulines humaines totales.

2. Réalisation pratique :

On prélève un premier sérum le plus tôt possible, puis un sérum tous les 8 jours (pendant 6 à 8 semaines parfois) pour observer une éventuelle séroconversion parfois tardive.

Compte-tenu du nombre d’espèces et de sérogroupes de Legionella, il est matériellement impossible de tester en routine les sérums vis-à-vis des antigènes correspondant à toutes les espèces de Legionella connues. Cette étude sérologique est facilitée par l’existence de réactions croisées entre différents sérogroupes de L. pneumophila et des réactions croisées entre différentes espèces de Legionella.

En pratique, on utilise des pools d’antigènes : L. pneumophila 1 à 4 et 5-6 ainsi que l’antigène monovalent L. pneumophila 1. En cas de positivité vis-à-vis d’un pool d’antigènes, un titrage est effectué vis-à-vis de chacun des antigènes monospécifiques.

Pour L. pneumophila et en utilisant l’antigène de Taylor, le diagnostic est considéré comme certain lorsque le titre d’anticorps s’élève de moins de 1/16^e à plus de 1/64^e et comme très probable lorsque le titre est stable à 17128^e.

3. Intérêt :

II permet souvent de confirmer une suspicion clinique du diagnostic et est parfois le seul moyen de confirmer un diagnostic.

La sensibilité avoisine 80 %. Avec l’antigène de Taylor, la spécificité est bonne. Il est à noter qu’il existe des faux positifs (Chiamydia et Mycoplasma, Pseudomonas).

La recherche d’IgM n’a pas d’intérêt pour cette sérologie.

E – Autres techniques :

1. Détection des anticorps par agglutination sur lame :

Cette technique facile d’emploi est intéressante pour L. pneumophila avec des résultats proche de l’IFI ; mais il existe de nombreuses réactions croisées entre les autres espèces de Legionella.

2. Détection des antigènes solubles par ELISA :

Les antigènes solubles de L. pneumophila 1 peuvent être détectés dans le sérum et les urines à l’aide d’un test ELISA utilisant des anticorps polyclonaux et monoclonaux.

La sensibilité dans les urines est proche de 80 % et la spécificité de l’ordre de 99 %.

3. Autres méthodes de détection :

L’amplification génique in vitro pourrait aboutir prochainement à une amélioration du diagnostic direct de cette bactérie.

V – TRAITEMENT – SENSIBILITÉ AUX ANTIBIOTIQUES :

In vitro, L. pneumophila est sensible à la rifampicine, au céfotaxime, à l’érythromycine, aux aminosides, aux tétracyclines, au chloramphénicol, aux pénicillines, aux nouvelles quinolones. Ce germe produit souvent une bêta-lactamase active sur les céphalosporines.

Ces données ne coïncident pas avec les résultats cliniques et le traitement classique est basé sur l’érythromycine par voie intra-veineuse actuellement associée à la rifampicine. Les fluoroquinolones sont de plus en plus employées seules ou en association.

VI – CONCLUSION :

Les Legionella représentent actuellement 5 à 10 % des étiologies des pneumopathies atypiques, et sont à ce titre responsables d’une évolution défavorable chez un certain nombre de patients immunodéprimés.

Leur isolement est actuellement à la portée de tout bon laboratoire qui veut s’en donner les moyens. Par contre, cet isolement étant long et fastidieux, il faut que ces demandes d’examen soient justifiées par une réelle suspicion clinique.